固定剂

固定剂最早用于光学显微镜，但光学显微镜使用的沉淀和凝集蛋白固定液并不特别适合电子显微镜。于是人们引入了四氧化锇和中性甲醛进行固定。在早期的电镜生物样品化学固定方法中，采用四氧化锇进行单一固定，但四氧化锇不能很好地保存糖原等碳水化合物，四氧化锇在组织中的渗出速度较慢（约2mm/h）

固定剂

电子显微镜使用的固定剂有毒，操作时要非常小心，尽量在通风柜内完成操作。如果固定剂在实验室泄漏，必须立即用大量奶粉覆盖泄漏的溶液，待反应充分后收集处理。

四氧化锇（Osmium   Antimony trioxide）

四氧化锇是一种强氧化剂，有淡黄色晶体，分子量254，饱和水溶液浓度为7.24%其水溶液呈中性，毒性极强。市场上有密封的四氧化锇晶体和四氧化锇水溶液两种。四氧化锇晶体在水中的溶解度很慢如果需要，可以使用超声波设备来加速溶解。市场上已经有准备好的两个了%四氧化锇水溶液有卖，用起来挺方便的。但要特别注意的是，晶体和水溶液都会挥发四氧化锇气体，所以四氧化锇要放在密闭的容器中（玻璃容器）中保存。四氧化锇气体对呼吸系统有刺激性，对眼睛有严重损害，使用时要特别小心，尽可能在通风柜中，并严格控制用量。废四氧化锇溶液应加入乙醇水溶液或硫酸亚铁溶液，使四氧化锇转化为黑色沉淀，以降低毒性，便于收集和处理。四氧化锇作为固定剂具有以下优点：

1.四氧化锇能与脂质反应、糖和蛋白质反应。其对脂质的固定作用可以弥补醛类固定剂在脂质固定方面的不足。

2.可以增加膜的对比度，发挥作用'电子染色'作用。用四氧化锇固定的材料往往具有清晰的细胞膜结构。这是因为被还原的锇沉积在细胞膜结构上，锇是原子序数较高的元素，可以增强它们的电子散射（质量密度大）因此，四氧化锇作为固色剂，还可以作为电子染料，使固色后的样品图像具有良好的对比度。

3.四氧化锇会破坏大部分细胞膜的半透膜特性，所以配制四氧化锇固定液时不必考虑渗透压。

四氧化锇虽然有以上优点，但也有很多缺点：

四氧化锇渗透性弱，所以组织块要小。否则组织块从表面到中间会形成一个固定的梯度，导致内部自溶过程继续，造成组织块内固定不良。

糖原无法保存，核酸无法有效固定，微管固定效果不理想。

固定时间不宜过长。时间过长，组织会变脆，切片困难。此外，四氧化锇和蛋白质、不饱和脂肪酸交联形成的络合物易溶于水，特别是长期固定后。因此，用四氧化锇固定样品12小时是合适的。

四氧化锇能被乙醇或醛氧化－还原反应，导致沉淀。因此，醛处理的样品在用四氧化锇固定前或用四氧化锇固定后用乙醇溶液脱水前，必须用相应的缓冲液充分漂洗。

四氧化锇是酶的钝化剂，所以它可以 它不能用于细胞化学的研究。

甲醛（formaldehyde）

甲醛的分子中只有一个碳原子，含有一个醛基，分子式为$CH_分子量为30的2O。虽然市场上有许多形式的甲醛溶液，但它们含有少量的甲酸和甲醇，对固定样品有不良影响适合电子显微镜固定的唯一溶液是多聚甲醛(Paraformaldehyde)新制备的甲醛溶液。甲醛溶液毒性很大，所以即使是稀释剂也要格外小心。甲醛溶液对皮肤有硬化作用，长期接触可能导致皮肤破裂、皮炎或过敏症状；甲醛挥发性很大，对呼吸道也有影响长期接触甲醛气体会降低嗅觉灵敏度；另外，甲醛对眼睛也有影响，也被认为是致癌物。因此，在处理甲醛粉末或溶液时，必须非常小心，戴上手套，并在通风柜中进行。少量废醛试剂（甲醛、戊二醛和丙烯醛等）可以在大量流水稀释的情况下直接倒入池中（但要注意相关部门的相关规定）当然，在大量流水的情况下，将少量醛类试剂与过量的1M甘氨酸混合后倒入池中更为安全。通常是100毫升甲醛(1%需要50毫升1M甘氨酸，100毫升1%戊二醛需要35ml，丙烯醛需要40ml。大量的醛类试剂必须回收并集中处理。

甲醛作为固定剂具有以下特点：

甲醛由于分子量小，穿透能力比戊二醛强，反应温和，因此可用于细胞化学研究中的预固定。而且不像戊二醛有两个醛基，它引入组织和细胞的游离醛基较少，所以在一些组织化学研究中更有优势。但其反应部分可逆，细胞基质保存较差，脱水后大部分基质丢失所以很多实验室不是单独用甲醛固定样品，而是和戊二醛混合制成固定液。

甲醛对生物样品的作用类似于戊二醛，主要引起蛋白质交联。在水溶液中，单个甲醛分子以HO CH2 OH的形式存在。

与戊二醛不同，甲醛与DNA和核蛋白都发生反应，但这些反应是部分可逆的。另外，甲醛固定脂质的能力不强，可与脂质的蛋白质效应有关。

戊二醛（glutaric dialdehyde）

戊二醛是一种含有两个醛基的五羰基醛。分子式为$C_5H_8O_分子量为100的2美元。电子显微镜固定通常使用市售的25%将戊二醛水溶液稀释至所需浓度。其pH为4.0$\sim$5.氧气、高温、中性或碱性pH会使戊二醛失去醛基，降低交联效率，所以这种原液平时应低温保存。另外，戊二醛存放时间过长，pH值会降低，颜色会变黄，固定效果也会大打折扣如果戊二醛的pH值降至3，.5或含有其他杂质，使用前必须净化。戊二醛能使皮肤变硬，但挥发性比甲醛弱，最好在通风柜中操作。

戊二醛作为固定剂具有以下特点：

它反应速度快，是一种优良的预固定剂。但其渗出速度较慢，必要时配合甲醛使用效果更佳。

它是蛋白质的强固定剂。它可以快速且不可逆地与氨基反应，类似于甲醛戊二醛的醛基与氨基反应，脱水后生成不稳定的席夫键化合物。

因为戊二醛有两个醛基，可以和另一个相邻的氨基反应产生交联。戊二醛的两个醛基也可以与相同的氨基反应形成环状结构

这种环状结构可以进一步与另一种戊二醛反应，生成丁醛缩合物(Aldol   condensate)这种化合物与氧分子相互作用产生稳定的嘧啶衍生物(Pyridine   derivative)并且在该过程中发生交联。

与甲醛不同，戊二醛反应的这一步是不可逆的，需要氧气的参与。由于大样本供氧不足，戊二醛在大样本中不能形成稳定的产物，会导致在样本中固定效果不佳。因此，戊二醛用于固定时，小样本的固定效果较为理想。戊二醛通过交联固定蛋白质的过程会伴随着氢离子的释放，使样品的pH值降低。为了将pH值稳定在最佳水平，应在戊二醛固定剂中加入足量的缓冲液。

戊二醛可以通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，保存糖原，也可以固定与蛋白质有关的或含有氨基和亚氨基的脂质。然而，单独用戊二醛固定的样品不能防止随后的脱水、样品的脂质是通过浸润包埋工艺提取的，因此固定细胞膜的效果并不理想。

戊二醛在固定过程中不会完全破坏细胞膜的半透膜特性，因此需要选择合适的固定液渗透压，避免出现固定错觉。然而，很难找到一个通用的渗透压，因为固定溶液的适当渗透压随着固定细胞和缓冲液的类型而变化。实际上，1美元.2.5\$戊二醛（使用0.1M磷酸盐缓冲液或0.1M二甲基胂酸盐缓冲液）总的来说，它已经能够提供理想的固定效果。除非观察到明显的渗透压引起的错觉，一般不会特别调整静止液体的渗透压。